۲۳۶۵۹پ
per
تولید پروتئین تلفیقیLHRH Melittin سم زنبورعسل در گیاه Nicotiana benthamiana با استفاده از ناقل ویروسی
Production of LHRH Melittin fusion protein of honey bee venom in Nicotiana benthamiana using viral vector
/زهید ناصری ملکی
: کشاورزی
، ۱۳۹۹
، میرزائی
۹۹ص
چاپی - الکترونیکی
دکتری
بیوتکنولوژی گیاهی
۱۳۹۹/۰۶/۲۶
تبریز
ملیتین پپتیدی با خواص ضد سرطانی و اصلی‌ترین جزء تشکیل‌دهنده زهر زنبورعسل است که به‌عنوان جایگزینی برای داروهای شیمی‌درمانی مطرح گردیده است .یکی از محدودیت‌های استفاده از این پپتید به‌عنوان دارو در درمان سرطان، تأثیر هم‌زمان آن بر سلول‌های سالم و بیمار می‌باشد .یک راهکار برای حل این مشکل، دارورسانی هدفمند بر اساس نشانگرهای اختصاصی سلول‌های سرطانی است .گیرنده هورمون آزادکننده گنادوتروپین (GnRHRیا LHRHR) یکی از مهم‌ترین نشانگرهایی است که در سطح بیش از ده نوع سلول سرطانی بیان می‌شود .بر اساس نظر دانشمندان این گیرنده ابزار مناسبی برای تحویل هدفمند دارو به سلول‌های سرطانی است و ازاین‌رو ممکن است راهکاری برای رفع محدودیت استفاده دارویی ملیتین نیز باشد .هدف این تحقیق تولید پروتئین تلفیقی lhmlt مبتنی بر هورمون GnRH و پپتید ملیتین می‌باشد که از سیستم بیان گذرا بر اساس ناقل ویروسی PVX و گیاه Nicotiana benthamiana برای تولید آن استفاده شد که دارای مزایای چون هزینه پایین، میزان بالای بیان و زمان کوتاه فرایند می‌باشد .برای این منظور ابتدا ساختار اسیدآمینه‌ای پروتئین تلفیقی بر اساس ضمایم آن ایجاد و مطالعات بیوانفورماتیک بر روی آن انجام شد .توالی اسیدآمینه‌ای حاصل بر اساس کدون‌های رایج گیاه Nicotiana benthamiana به توالی DNA تبدیل و پس از بهینه‌سازی‌های، در ناقل ویروسی PVX همسانه‌سازی شد .ناقلlhmlt - PVXبه‌صورت هم‌زمان با ناقلP۱۹ (- pCAMBIAپروتئین بازدارنده خاموشی ژن (به درون بافت گیاهی اگرواینفیلتراسیون شد .بررسی بیان پروتئین lhmlt از طریق لکه‌گذاری وسترن و تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون کبالت انجام شد .عملکرد پروتئین lhmlt از طریق آزمون MTT بر روی سلول‌های سرطانی سینه MCF۷ که گیرنده GnRHR در سطح آن بیان می‌شود، مورد ارزیابی قرار گرفت .نتیجه مطالعات بیوانفورماتیک حاصل از سرورTASSER - Iنشان داد که ساختار ثانویه هریک از اجزا پس از اتصال ثابت باقی مانده و تغییری در ساختار یکدیگر به وجود نمی‌آورند و نیز مطالعه اتصال (Docking) پروتئین تلفیقی و گیرنده GnRHR مؤید اتصال بخش هورمونی پروتئین تلفیقی) لیگاند (با گیرنده اختصاصی خود بود .نتیجه لکه‌گذاری وسترن تائید کننده بیان پروتئین نوترکیب و همچنین مؤید نتایج پیش‌بینی عملکرد سیگنال‌پپتید Acidic Endochitinase Qبا استفاده از سرور۴.۰ - SignalPبود که به‌منظور شروع ترجمه و ممانعت از اضافه شدن متیونین به ابتدای پروتئین تلفیقی اضافه شده بود .پروتئین lhmlt در غلظت ۳۱۲نانوگرم بر میکرو لیتر باعث مرگ ۹۶ درصد از سلول‌های سرطانی شد .این حد از تأثیرگذاری می‌تواند در اثر اتصال پروتئین تلفیقی به گیرنده GnRHR در سطح سلول‌های سرطانی باشد که نیازمند بررسی بیشتر است .پس از تخلیص، میزان پروتئین نوترکیب، در حدود یک گرم بر کیلوگرم وزن تر گیاهی برآورد شد
Melittin peptide is the main component of honey bee venom with the cytotoxic and anti-cancer effect which can affect healthy and cancerous cells simultaneously, so needed a proper solution for targeted use. The unique and overexpressed surface-receptor of the cancerous cells provide potential to deliver cytotoxic substances directly to cancerous cells. Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Receptor (GnRHR) is one of the most important receptors, overexpressed on the surface of more than ten type cancerous cells. In this study, we attempted to produce a fusion protein (lhmlt) based on melittin and GnRH and investigate its effects on cancerous cell line that have GnRHR receptors at their surface. Due to the high expression level, short needed time and cost-effective, the transient expression method, based on PVX viral vector and Nicotiana benthamiana host, was used for the production of the fusion protein. After bioinformatics studies and docking analysis for lhmlt-GnRHR interaction, a codon-optimized gene with the 44 GC content and 0.8 CAI, encoding Acidic Endochitinase Q signal peptide (AEQ), lhmlt fusion protein and 6xHis-tag, was subcloned into PVX viral vector and was transferred into Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain. The plants were co-agroinfiltrated with PVX-lhmlt and pCAMBIA-P19 expression vector of the P19 gene-silencing suppressor. The lhmlt expression was confirmed by western blotting analysis and was purified by cobalt chromatography column. The effect of lhmlt fusion protein was investigated by MTT assay on the MCF7 cancer cell line, which has the GnRHR receptor. The results of bioinformatics studies from the I-TASSER server showed that the secondary structure of each component remained constant after the connection and did not alter the structure of each other. Docking the refined lhmlt 3D structure and the GnRHR receptor showed that the hormonal part of the fusion protein can bind to its specific receptor. The prediction of the performance of the AEQ peptide signal, which was used to start the translation and prevent the addition of methionine to the beginning of the fusion protein, was confirmed using the SignalP-4.0 server. The final optimized DNA sequence was a 228-nucleotide sequence with a GC content of 44.2982 and a CAI index of 0.8329. The results of western blotting confirmed the expression of recombinant protein and the correct functioning of the AEQ peptide signal. Cell test results showed that the lhmlt fusion protein in the concentration of 310 ng/ml inhibited 96 of MCF7 cancer cell growth. This effect can be due to the binding of the fusion protein to the GnRHR receptor at the surface of cancer cells, which requires further investigation. After purification, the amount of recombinant protein was estimated to be about 1g/kg of plant weight
Production of LHRH Melittin fusion protein of honey bee venom in Nicotiana benthamiana using viral vector
ناصری ملکی، زهید
Naseri Maleki, Zahid
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
