عنوان

تولید گیاه توتون ترانسپلاستوم برای اینترفرون بتای انسانی نوترکیب

پ۲۸۷۲۵

per

تولید گیاه توتون ترانسپلاستوم برای اینترفرون بتای انسانی نوترکیب

اصغر فیضی

کشاورزی

۱۴۰۰

۹۷ص.

سی دی

دکتری

اصلاح نباتات (گرایش ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک)

۱۴۰۰/۰۶/۲۹

مهندسی ژنتیک کلروپلاست یک روش مناسب برای تولید پروتئین نوترکیب، از طریق افزایش سطح بیان ژن تراریخت می‌باشد. اینترفرون بتای نوترکیب INF-β یک سیتوکین‌ انسانی و داروی مهم در درمان بیماری ام اس است. تاکنون گزارشی از بیان این پروتئین نوترکیب در کلروپلاست نشده است. پژوهش حاضر به هدف بیان ژن اینترفرون بتای انسانی نوترکیب (rhIFN- β) در ژنوم کلروپلاست گیاه توتون انجام گرفته است. ابتدا توالی ژن اینترفرون بتای انسانی با استفاده از الگوریتم اوپتیمم‌ژن برای بیان در کلروپلاست توتون بهینه سازی و سپس سنتز شده و در بانک ژن NCBI به شماره (MH285815.1) ثبت شده. کدون بهینه شده‌ی rhIFN- β به ناقل پلاستید pPRV111A حاوی ژن aadA به عنوان ژن گزینشگر انتقال داده شد و با استفاده از تفنگ ژنی، به طور موفقیت‌آمیزی وارد ژنوم کلروپلاست توتون گردید. نتایجPCR و تجزیه‌ی سادرن بلات انتقال ژن rhIFN- β در ژنوم کلروپلاست و هموپلاسمی نتاج T1 را تأیید کرد. نتایج RT-PCR و تجزیه‌ی وسترن بلات به ترتیب رونویسی و ترجمه‌ی ژن مذکور را در ژنوم کلروپلاست توتون تأیید کرد. تجزیه‌ی الایزا (ELISA) نشان داد که پروتئین rhIFN- β در گیاهان تراریخته کلروپلاستی تقریباً 4/2 درصد از کل پروتئین محلول را تشکیل می‌دهد. این میزان بیان ژن بسیار بیشتر از میزان بیان همین ژن در هسته است، با این حال گزارشهایی از سطح بیان بسیار بالاتر پروتئین های نوترکیب در کلروپلاست توتون نیز وجود دارد. در ادامه پیشنهاد می شود فعالیت زیستی پروتئین تولید شده و راهکارهای افزایش بیان و تولید پروتئین بررسی شود.

Abstract:Chloroplast genetic engineering is a convenient method for the production of recombinant proteins by increasing the expression level of transgenes. Beta Interferon (IFN-β) is a member of type I interferons which offer some pharmaceutical properties. The present study aimed to investigate the overexpression and production of the recombinant human interferon-beta gene (rhifn-β) in the tobacco chloroplast genome. Following the results, a codon-optimized rhifn-β was transferred to the pPRV111A plastid vector containing the aadA gene as a selectable marker. It was successfully introduced to the tobacco chloroplast genome using a gene gun. The integration of the rhIFN-β gene into the chloroplast genome and the homoplasmy of the T1 progeny were confirmed by PCR and Southern blot analysis. RT-PCR and Western blot analyses confirmed the transcription and translation of the rhifn-β gene. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed that the rhIFN-β protein in transplastomic plants comprised approximately 2.4% of total soluble protein (TSPs). This level of gene expression is much higher than the level of expression of the same gene in the nucleus, however, there are reports of a much higher level of expression of recombinant proteins in tobacco chloroplasts. Further research to Investigate the biological activity of the produced protein and ways to increase protein expression and production is recommended .

Developing Transplastomic Tobacco for Recombinant Human Interferon Beta

‏فیضی،

‏اصغر

تهیه کننده

‏باغبان کهنه روز،

قلی زاده،

‏بهرام

‏ اشرف

استاد راهنما

استاد مشاور

تبریز