عنوان

طراحی ناقل بیانی پلاستیدی و تولید دارپین ساختگی جایگزین تراستوزومب در گیاه توتون ترانسپلاستوم

Number

پ۲۶۵۹۴

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

طراحی ناقل بیانی پلاستیدی و تولید دارپین ساختگی جایگزین تراستوزومب در گیاه توتون ترانسپلاستوم

First Statement of Responsibility

مریم احساسات‌وطن

Name of Publisher, Distributor, etc.

کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

۱۴۰۰

Specific Material Designation and Extent of Item

۱۴۷ص.

Accompanying Material

سی دی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

بیوتکنولوژی کشاورزی

Date of degree

۱۴۰۰/۱۲/۲۳

Text of Note

چکیده:پروتئین‌های تکرار آنکرینی طراحی شده (دارپین‌ها) پروتئین‌های داربست غیرایمونوگلوبولینی نسبتاً کوچکی هستند که با تمایل بالا به اهداف اختصاصی خود متصل می‌شوند. G3 یک نوع دارپین طراحی شده برای اتصال به پروتئین گیرنده تیروزین کیناز HER2 (گیرنده 2 فاکتور رشد اپیدرمی انسان) است. بیان بیش از حد HER2 در برخی از سرطان‌ها از جمله سرطان سینه شایع بوده و می‌تواند به ‌عنوان نشانگر پیش‌آگهی و پیش‌بینی کننده سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف این تحقیق توسعه یک فرآیند زیستی برای تولید دارپین G3 به عنوان عامل تصویربرداری در سرطان‌های با بیان بالای HER2 در سیستم بیان کلروپلاستی توتون می‌باشد. به این منظور، ابتدا توالی نوکلئوتیدی دارپین G3 از ترجمه معکوس توالی آمینو اسیدی موجود در داده پایگاه Protein Data Bank، همزمان با بهینه‌سازی بر اساس رمز‌های ترجیحی کلروپلاست توتون (Nicotiana tabacum) به دست آمد. در کاست طراحی شده از توالی راه‌انداز rrn توتون و توالی 5ˊ UTR بهینه‌سازی شده ژن T7g10، شامل توالی افزاینده TTAACTTTA، توالی 10 نوکلئوتیدی فاصله دهنده پلی-A بین موتیف اپسیلون و جایگاه اتصال ریبوزوم، توالی TAAGGAGTG به عنوان جایگاه اتصال ریبوزوم و توالی پایان‌دهنده اپرون rrnB باکتری E. coli استفاده شد. جهت تسهیل تخلیص پروتئین تولید شده توالی برچسب هیستیدینی در انتهای آمینی توالی رمز کننده دارپین G3 تعبیه شد. توالی نهایی کاست بیانی پس از سنتز در ناقل کلروپلاستی pPRV111A زیر‌ همسانه‌سازی شد. انتقال ناقل حاوی توالی رمز کننده دارپین G3 به ریزنمونه‌ برگی توتون با استفاده از روش بمباران ذره‌ای انجام شد و باززایی گیاهان ترانسپلاستوم در محیط گزینش حاوی 500 میلی‌گرم در لیتر اسپکتینومایسین صورت گرفت. گیاهان ترانسپلاستوم هموپلاسم پس از سه دوره گزینش در حضور آنتی‌بیوتیک‌های استرپتو/اسپکتینومایسین بدست آمدند. تأیید اولیه تراریختی و حضور ژن دارپین G3 در گیاهچه‌های رشد یافته در محیط گزینش با استفاده از آنالیز PCR انجام شد. آنالیز لکه‌گذاری سادرن وضعیت هموپلاسمی گیاهان ترانسپلاستوم را تأیید کرد. آنالیز لکه‌گذاری وسترن تجمع دارپین G3 در کلروپلاست گیاهان ترانسپلاستوم را تأیید کرد. محتوی دارپین G3 تولید شده در کلروپلاست گیاهان ترانسپلاستوم با استفاده از الایزا 2/21 درصد پروتئین محلول کل برگ و 7/33 درصد پروتئین محلول کل کلروپلاست برآورد شد. خالص‌سازی پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تثبیت شده با یون فلزی (IMAC) انجام شد و پروتئین خالص‌سازی شده با استفاده از الکتروفورز به روش SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت. آزمون الایزا تمایل اتصال دارپین G3 به دمین خارج سلولی گیرنده HER2 در حد پیکومولار را تأیید کرد. نتایج فلوسایتومتری و بررسی توسط میکروسکوپ فلورسنت اتصال اختصاصی دارپین G3 به گیرنده HER2 در سطح رده‌های سلولی سرطانی را نشان داد. نتایج این مطالعه نشان‌دهنده کارایی کلروپلاست توتون در تولید داربست‌های پروتئینی با کاربرد درمانی و تشخیصی می‌باشد. این مطالعه، اولین گام اساسی به سمت تولید داربست‌های پروتئینی در سیستم بیانی مبتنی بر گیاه را اثبات می‌کند.

Text of Note

AbstractDesigned ankyrin repeat proteins (DARPin) are relatively small non-immunoglobulin scaffold proteins that are binds to their specific target with high affinity. The G3 is a type of DARPin designed to binding to the HER2 tyrosine kinase receptor (human epidermal growth factor receptor 2). Over expression of HER2 is common in some cancers, including breast cancer and can be used as a prognostic and predictive of cancer. The aim of this research is to develop a bioprocess for the production of DARPin G3 in tobacco chloroplasts as an imaging agent in HER2 over-expressed cancers. For this purpose, the DARPin G3 gene nucleotide sequence was obtained from reverse translation from a previously characterized DARPin G3 amino acid sequence deposited in Protein data Bank database, simultaneously with codon optimization based on the codon usage of tobacco (Nicotiana tabacum) chloroplast. DARPin G3 expression cassette was constructed by fusing the coding region with the rRNA operon promoter (Prrn) and a T7g10 5´UTR-derived leader sequence at the 5´-end and the rrnB 3´UTR from E. coli at the 3´-end. 5´UTR sequence contained a strong ribosome binding site (TAAGGAGTG), epsilon motif as an enhancer sequence (TTAACTTTA) and poly-A-spacer between the epsilon motive and the RBS. To facilitate the purification of the protein, the histidine tag sequence was embedded at the 5´ end of the DARPin G3 encoding sequence. The final DARPin G3 encoding cassette with translation control elements was subcloned into pPRV111A. The transformation was performed using the particle bombardment method on tobacco leaf explants and the regeneration of transplastomic plants in the selection medium containing 500 mg/l streptomycin. Homoplasmic shoots were re-regenerated thrice under stringent spectinomycin /streptomycin selection pressure. The preliminary confirmation of transgenesis, presence of transferred gene in transplastomic shoots developed on selection medium were carried out by PCR analysis. Southern blot analysis confirmed the homoplasmic statues of transplastomic plants. The western blot analysis confirmed the accumulation of the DARPin G3 in chloroplasts of transplastomic plants. The DARPin G3 protein content was estimated by ELISA 20.2% of leaf TSP and 33.7% of chloroplast TSP in the transplastomic plants. Protein purification was performed using immobilized-metal affinity chromatography (IMAC) and purified protein was investigated by SDS-PAGE. ELISA confirmed the binding of G3 to extracellular domain of HER2 receptor with picomolar affinity. The flow cytometry results and fluorescence microscopy showed the specific binding of the DARPin G3 to the HER2 receptor in the surface of cancer cell line. The results of this study indicate the efficiency of chloroplast in the production of scaffold proteins with therapeutic or diagnostic application. This study proves the first major step towards the production of scaffold protein in plant-based expression system.

Variant Title

Designing plastidial expression vector and production of synthetic DARPin as a trastuzumab substitute in transplastomic tobacco plant

Entry Element

‏ احساسات‌وطن،

Part of Name Other than Entry Element

‏مریم

Relator Code

تهيه کننده

Entry Element

‏باغبان کهنه‌روز،

Entry Element

‏قلیزاده،

Entry Element

شانه‌بندی،

Part of Name Other than Entry Element

‏بهرام

Part of Name Other than Entry Element

‏اشرف

Part of Name Other than Entry Element

‏داریوش

Dates

استاد راهنما

Dates

استاد مشاور

Dates

استاد مشاور

Entry Element

‏ تبریز